Обзор методов иммобилизации ферментов
В предыдущей статье мы упоминали, что горькие вещества в цитрусовых в основном состоят из нарингина, который может быть постепенно разложен на глюкозу и нарингенин под действием нарингиназы, и в итоге достигается цель дебетования. В реальном процессе производства и использования, по сравнению со свободными ферментами, иммобилизованные ферменты не только имеют более высокую каталитическую эффективность и лучшую специфичность, но также повышают устойчивость к суровым условиям и продлевают срок службы ферментов; в то же время, иммобилизованные ферменты удобно отделять от продукта реакции, упрощать процесс производства и снижать стоимость. Поэтому здесь дается краткое введение в методы иммобилизации распространенных ферментов.
Под иммобилизованным ферментом понимается фермент, который закреплен на определенном носителе для обеспечения нерастворимости в воде и при этом сохраняет каталитические свойства. Еще в 1954 году Глубхофер и Шлейт использовали метод диазотирования для модификации полистирольной смолы с целью иммобилизации пепсина и карбоксипептидазы для приготовления иммобилизованных ферментов. Затем в 1969 году японский ученый Чи Яничиро использовал иммобилизованную ацилированную аминокислоту, чтобы впервые осуществить непрерывное производство L-аминокислоты, что способствовало быстрому развитию технологии иммобилизации в ферментной инженерии. Когда появились иммобилизованные ферменты, существовало множество различных названий, но на первой Международной конференции по инженерии ферментов в 1971 году было официально предложено использовать термин «иммобилизованные ферменты». Реакция, катализируемая ферментом, имеет мягкие условия, высокую каталитическую эффективность и высокую специфичность. В то же время фермент легко разлагается и является экологически чистым. Иммобилизованный фермент не только сохраняет эти характеристики фермента, но и обладает многими свойствами, которыми трудно обладать свободному ферменту, такими как: ① легкость отделения от реакционной системы; ② возможность вторичной переработки; ③ повышение стабильности фермента в суровых условиях; ④ возможность осуществления ферментного катализа в неводной фазе; ⑤ возможность создания мультиферментной системы с непрерывной реакцией. Поскольку иммобилизованные ферменты могут иметь важное прикладное значение в медицине, пищевой промышленности, охране окружающей среды и т.д., в последние годы они привлекают внимание ученых и находят широкое применение в промышленности.
К распространенным методам иммобилизации ферментов в основном относятся метод адсорбции, метод встраивания, метод сшивания и метод ковалентной связи. Первые два относятся к физическим методам, а два последних — к химическим. Принцип действия этих методов иммобилизации фермента показан на рисунке 1.
Рисунок 1 Метод иммобилизации фермента
1 Адсорбционный метод
Адсорбционный метод — это метод полной иммобилизации за счет поверхностной адсорбции носителя на фермент или за счет взаимодействия положительных и отрицательных зарядов между носителем и ферментом, включая физическую адсорбцию и ионную адсорбцию.
физическая адсорбция
Метод физической адсорбции — это метод фиксации фермента на поверхности носителя с использованием адсорбционного эффекта носителя на ферменте. Метод прост в применении, не требует модификации и активации, активный центр фермента хорошо сохраняется, но сила связывания низкая, и его силой в основном являются межмолекулярные силы и поверхностное натяжение. В качестве адсорбентов для иммобилизации ферментов обычно используют активированный уголь, графен, кизельгур и другие нерастворимые в воде адсорбенты с сильной водопоглощающей способностью. Чжао и др. использовали восстановленный оксид графена в качестве носителя для совместной иммобилизации глюкозооксидазы и глюкоамилазы с целью получения иммобилизованного композитного фермента.
адсорбция ионов
Метод ионной адсорбции — это метод иммобилизации фермента за счет взаимодействия положительных и отрицательных зарядов между носителем и ферментом. Этот метод имеет мягкие условия подготовки, и активность фермента не так легко потерять, но сила связывания также слабая и легко отпадает. Матео и др. подготовили новый тип ионообменной смолы для фиксации липазы, β-галактозидазы и аминокислотной оксидазы соответственно. В условиях pH 7,0 и 4 ℃ фермент достигает адсорбционного насыщения в течение нескольких минут, а скорость восстановления активности фермента достигает 100%, что свидетельствует о хорошем эффекте иммобилизации.
2 Метод встраивания
Метод встраивания — это метод, при котором фермент встраивается в пористый материал, и включает в себя метод встраивания в гель и метод встраивания в полупроницаемую мембрану. Метод встраивания в гель — это метод фиксации, при котором фермент встраивается во внутреннюю сетевую структуру геля (рис. 1B-a). Чжан Шусян и другие использовали альгинат натрия для встраивания грибковой лакказы для обработки сточных вод бумажного производства с низкой концентрацией. Максимальная скорость восстановления активности фермента составила 48 %, а активность фермента сохранилась на 64 % после 8 запусков. Метод встраивания в полупроницаемую мембрану — это метод иммобилизации ферментов в полупроницаемой мембране из высокомолекулярных полимеров (рис. 1B-b). Этот метод также не требует химической модификации и не влияет на активность фермента, но при этом не так просто контролировать размер мембраны. Трудно поддерживать активность фермента, контролируя свободный вход и выход реактивов и продуктов без утечки фермента. Поэтому при практическом использовании этот метод обычно комбинируют с другими методами. Rilling P et al. использовали носитель для иммобилизации белковых молекул в микрокапсуле, что не только повысило стабильность иммобилизованного фермента, но и улучшило его свойства.
3 Метод сшивания
Метод сшивания — это метод, при котором молекулы фермента сшиваются друг с другом с помощью бифункциональных или многофункциональных реагентов, а молекулы фермента и реагенты образуют ковалентную связь и фиксируются. Иммобилизованный фермент, приготовленный этим методом, обладает хорошей стабильностью, но некоторые группы фермента, такие как амино-, сульфгидрильные, имидазолильные и т.д., могут участвовать в реакции сшивания. Если выбранный сшивающий агент и функциональная группа не подходят, структура активного центра фермента может быть разрушена, что приведет к серьезной потере активности фермента, поэтому этот метод обычно комбинируют с другими методами. Ли Сяоцзин и другие сначала инкапсулировали пепсин с раствором альгината натрия, затем по каплям добавляли к раствору, содержащему определенную концентрацию хитозана и CaCl2, чтобы получить иммобилизованные микросферы фермента, затем добавляли определенное количество глутаральдегида для сшивания, чтобы получить иммобилизованный пепсин. Этот метод позволил получить иммобилизованный фермент с хорошей операционной и термической стабильностью.
4 Метод ковалентного сшивания
Метод ковалентного связывания (также известный как метод ковалентного связывания) — это метод иммобилизации фермента путем образования ковалентной связи между ферментом и носителем (как показано на рисунке 2).
Рисунок 2 Иммобилизованный фермент методом ковалентного связывания, A-активный аминокислотный остаток; B-связывающая группа на носителе; C-носитель.
Методы ковалентного связывания обычно включают три типа: (1) носитель модифицируется и активируется, а затем ковалентно связывается с молекулой фермента; (2) носитель и молекула фермента ковалентно связываются с помощью агента сопряжения; (3) молекула фермента модифицируется после активации, она соединяется с носителем. Среди них чаще всего используется первый тип. После активации носителя для присоединения определенных активных групп, таких как амино, эпоксид и т.д., к активному остатку молекулы фермента (такому как амино, карбоксил, гидроксил и т.д.), фермент иммобилизуется. Этот метод гораздо надежнее, чем метод адсорбции. В то же время, поскольку носитель обычно больше, аминокислотные остатки, участвующие в реакции на ферменте, как правило, находятся на периферии фермента, и влияние на активный центр фермента относительно невелико. Это отличный метод иммобилизации ферментов. Янь Келян и другие использовали аминосиланизированные магнитные наночастицы для иммобилизации пектиназы, и скорость иммобилизации и восстановления активности фермента составила 44,44 % и 40,86 %, соответственно, что позволило достичь хорошего эффекта иммобилизации. В следующей статье мы продолжим подробно знакомить вас с различными методами получения магнитных биополимерных микросфер.
Свяжитесь с нами сейчас!
Мы принимаем индивидуальные услуги, обычно мы свяжемся с вами в течение 24 часов. Вы также можете написать мне по электронной почте info@longchangchemical.com в рабочее время (с 8:30 утра до 6:00 вечера UTC+8 пн.~сб.) или воспользоваться чатом на сайте, чтобы получить быстрый ответ.
Эта статья была написана отделом исследований и разработок Longchang Chemical. При копировании и перепечатке, пожалуйста, указывайте источник.