1. Метод определения активности фермента нарингиназы
1-1 Спектрофотометрический метод
Спектрофотометрический метод п-нитрофенола использует п-нитрофенол- α-рамнозид ( pNP- α- Rha ) и п-нитрофенол-β-D-глюкопиранозид ( pNP- β-Glu ) в качестве субстрата для определения активности ферментов α-рамнозидазы и β-глюкозидазы. Ли Пин использовал метод п-нитрофенольного спектрофотометра, в эксперименте добавляя β-глюкозидазу Aspergillus niger в раствор п-нитрофенол-β-глюкозида ( pNPG ) для ферментативного гидролиза, и значение абсорбции измерялось при длине ультрафиолетовой волны 400 нм. На основании значения абсорбции рассчитывали активность фермента β-глюкозидазы. Этот метод обладает сильной субстратной специфичностью, но стандартный субстрат дорогой, и активность фермента нарингиназы для гидролиза гликозидов в пищевых продуктах не может быть определена, поэтому этот метод не подходит для определения активности фермента при промышленном крупномасштабном приготовлении нарингиназы.
Принцип метода спектрофотометра Дэвиса заключается в том, что нарингин может вступать в хромогенную реакцию с 90% диэтиленгликолем в слабощелочных условиях, и желтое образование халькона нарингина может быть обнаружено под ультрафиолетовым светом с длиной волны 420 нм. По измеренному значению абсорбции можно рассчитать оставшееся количество субстрата нарингина, а затем расчетным путем получить активность нарингиназы. Ван Вейна и др. использовали усовершенствованный метод Дэвиса, взяли нарингин в качестве субстрата и добавили нарингиназу, полученную в результате жидкой ферментации Aspergillus niger FFCC 848, для ферментативного гидролиза. Абсорбцию измеряли при ультрафиолетовом свете 420 нм, а затем рассчитывали активность фермента. Метод спектрофотометра Дэвиса для измерения активности фермента прост в эксплуатации, имеет высокую скорость, поэтому данный метод широко используется для своевременного определения производства нарингиназы путем ферментации и активности иммобилизованной нарингиназы.
1-2 Высокоэффективная жидкостная хроматография
Принцип высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) заключается в том, что ВЭЖХ может точно определить и количественно проанализировать субстрат нарингин, промежуточный продукт пурунин и конечный продукт нарингенин в течение всего процесса гидролиза, а затем рассчитать активность фермента. Чэнь Юэлун и другие использовали ВЭЖХ для определения времени удерживания нарингина, арбутина, мирицетина и их продуктов, добились полного разделения с разрешением более 1,5 и эффективно контролировали влияние нарингиназы на многочисленные гликозиды в процессе гидролиза, в то же время активность фермента была определена точно. Метод ВЭЖХ обладает преимуществами высокой точности и позволяет избежать вмешательства примесей, но по сравнению с методом Дэвиса этот метод имеет более длительное время обнаружения и более сложную операцию.
1-3 Усовершенствованный метод определения активности фермента нарингиназы
Использование усовершенствованного метода Дэвиса: 0,8 мл 0,8 г-л-1 раствора нарингина, приготовленного с использованием буфера pH 4,5, добавляют в реакционную систему, содержащую 40 мг иммобилизованной нарингиназы (или 0,2 мл свободной нарингиназы). Поместите ее в водяную баню с постоянной температурой 50 ℃ на 30 минут. Возьмите 0,1 мл реакционного раствора ферментативного гидролиза и добавьте в пробирки 5 мл диэтиленгликоля (объемная доля 90%) и 0,1 мл раствора NaOH (4 моль-L-1), выдержите 10 мин после равномерного перемешивания. Измерьте абсорбцию смешанного раствора при 420 нм.
Определение активности фермента нарингиназы (U): в условиях pH 4,5, 50 ℃, 1 единица активности фермента — это количество фермента, необходимое для деградации 1 мкг нарингина в минуту. Коэффициент активности фермента (U-g-1 или U-mL-1) определяется как: при условии pH 4,5, 50 ℃, активность фермента, проявляемая 1 г иммобилизованной нарингиназы (или 1 мл свободной нарингиназы). Относительная активность фермента рассчитывается по следующей формуле:
Относительная активность фермента /% = активность фермента/максимальная активность фермента×100
Определение стандартной кривой: концентрацию массы стандартного раствора гликозида нарингина устанавливают 0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 г — Л-1, затем 0,1 мл раствора берут для реакции с 5 мл диэтиленгликоля (90%, в/в) и 0,1 мл раствора гидроксида натрия (4 моль-Л-1). После равномерного перемешивания смеси и отстаивания в течение 10 мин измеряли значение светопоглощения смешанного раствора при 420 нм и строили стандартную кривую.
2. Приготовление раствора фермента нарингиназы
Aspergillus niger FFCC uv-11, хранившийся при температуре 4 ℃, был перенесен на питательную среду, и зрелые споры были получены путем культивирования при постоянной температуре 30 ℃ в течение 96 ч. Затем споры были промыты. Затем споры промывали стерильным нормальным физиологическим раствором с массовой долей 0,9%. Значение абсорбции суспензии спор измеряли при 600 нм (значение OD600), при этом значение OD600 в стерильном физиологическом растворе доводили до 0,200. Затем суспензию спор с объемной долей 10% инокулировали в 100 мл ферментационной среды (250 мл коническая колба), полученный ферментационный бульон центрифугировали при 4 ℃ и 6000 об/мин-1 в течение 10 мин в охлаждаемой центрифуге. Затем через всасывающий фильтр получали надосадочную жидкость, необходимую для получения фермента нарингина. Охладите ее при 4 ℃ для последующего использования.
3. Приготовление иммобилизованного на хитозане фермента нарингиназы
Возьмите 3,0 г хитозана, с 100 мл объемной доли 2% раствора уксусной кислоты был растворен для подготовки 0,3 г — L-1 хитозана коллоидный раствор, sonicated в течение 20 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха и позволили ему полностью раствориться. Коллоидный раствор хитозана капля за каплей вводили иглой в 0,5 г — L-1 конденсата NaOH (1000 мл) до образования гладких гранул. Гранулы выдерживали при комнатной температуре в течение 3 ч, затем их многократно промывали дистиллированной водой до нейтрального состояния, а воду поглощали фильтровальной бумагой для получения хитозановых микросфер. 0,4 г хитозановых микросфер взвешивали, добавляли 0,4 мл глутаральдегида с объемной долей 6% и многократно промывали микросферы дистиллированной водой до отсутствия глутаральдегида на поверхности микросфер при постоянной температуре и вибрации при 25 ℃ 150 об/мин-1 в течение 2 ч. Сшитые хитозановые микросферы получали путем сушки фильтровальной бумагой.
Он сказал 0,4 г хитозана микросфер, добавить 0,4 мл члена количество кредитов 6% глутаральдегида, при 150 об — мин-1 при 25 ℃ колебания температуры После 2 ч, промывают несколько раз дистиллированной водой микро-сферу на поверхность его не пентил диальдегида и фильтровальной бумаги высушивают для получения сшитых хитозана микросфер. Возьмите 4 мл ферментного раствора нарингиназы, добавьте его к 0,4 г сшитых хитозановых микросфер, встряхните при постоянной температуре 25 ℃, 150 об/мин-1 в течение 2 ч, и поместите в холодильник при температуре 4 ℃ для адсорбции Coupling в течение 4 ч. Промойте остаточный раствор фермента на поверхности носителя буфером pH 4,5, впитайте воду на фильтровальной бумаге, чтобы получить иммобилизованную нарингиназу, и храните ее в холодильнике при температуре 4 ℃ для последующего использования.
4. Приготовление магнитных микросфер из хитозана на основе кремния (MSC)
Рисунок 1 Схема получения магнитных наночастиц на основе кремния
( 1) Сначала магнитные наночастицы Fe3O4, модифицированные лимонной кислотой, были приготовлены методом химического соосаждения, экспериментальная процедура включает: 2,25 г FeCl3-6H2O и 1,61 г FeSO4-7H2O добавляют в трехгорлую колбу, заполненную 100 мл деионизированной воды, температура системы была нагрета до 85 ℃ при условии азота газа. Перемешайте при 1000 об/мин-1 и быстро прилейте 10 мл концентрированной аммиачной воды. После того как раствор почернеет, добавьте 153 мг цитрата натрия. После 30 минут реакции отделите продукт с помощью магнита, а твердую фазу промойте несколько раз деионизированной водой и этанолом. Полученные наночастицы Fe3O4 высушивают для дальнейшего использования.
( 2) Затем методом золь-гель были получены магнитные наночастицы на основе кремния (MS), показанные на рис. 1. Экспериментальные шаги включают: 0,1 г наночастиц Fe3O4 равномерно диспергировали в смешанном растворе, содержащем 40 мл безводного этанола, 10 мл дедистиллированной воды и 1,2 мл концентрированной аммиачной воды. При перемешивании со скоростью 300 об/мин-1 капли раствора, содержащего наночастицы Fe3O4, добавляли к ТЭОС (0,4 мл), диспергированному в 30 мл безводного этанола, и реакцию получения наночастиц на основе кремния проводили в течение 12 ч при комнатной температуре. Продукты промывали безводным этанолом и дистиллированной водой несколько раз, чтобы получить магнитные наночастицы на основе кремния (МС), которые высушивали для дальнейшего использования.
Микросферы МСК были приготовлены методом эмульсионной сшивки, как показано на рис. 2. Экспериментальные этапы включали: 0,125 г магнитных наночастиц диоксида кремния (МС) равномерно диспергировали в 10 мл раствора хитозана с массовой долей 2,5%, приготовленного путем растворения хитозана в растворе уксусной кислоты с объемной долей 5,0%, а затем добавляли раствор хитозана в эмульсию, содержащую 60 мл жидкого парафина и 1,8 мл твина 80 капля за каплей. После перемешивания в течение 30 мин при 40 ℃ водяной бани и 800 об/мин-1 добавляют 2,0 мл глутаральдегида и проводят реакцию в течение 1 ч. Затем pH системы регулируют до 9,0 с помощью 1 моль-л-1 NaOH, и реакцию продолжают в течение 1 ч. Продукты промывают петролейным эфиром, этанолом и дистиллированной водой несколько раз для получения микросфер MSC, которые сушат в вакууме для дальнейшего использования.
Рисунок 2 Схема получения магнитных микросфер из хитозана на основе кремния
5. Приготовление магнитных хитозановых микросфер на основе эпоксидной смолы (MSCE)
0,5 г высушенных микросфер МСК, приготовленных по методу 4, взвешивали и добавляли в коническую колбу объемом 50 мл. Затем в колбу добавили по 2,0 мл раствора NaOH, раствора эпихлоргидрина и раствора NaBH4 определенной концентрации, соответственно. Реакцию проводили при постоянном колебании температуры в течение определенного времени. Реакционный механизм получения MSCE представлен на рисунке 3.
Рисунок 3. Принцип получения эпоксидных магнитных микросфер из хитозана на основе кремния
После активации активированные микросферы многократно промывают дистиллированной водой до отсутствия свободных OH- и эпоксидных групп на поверхности для получения эпоксидных магнитных микросфер на основе хитозана на кремнии (MSCE). Метод обнаружения заключается в следующем: возьмите 3,0 мл промывочного супернатанта и добавьте 1~2 капли фенолфталеина. Если после встряхивания раствор не покраснел, значит, в MSCE нет свободных OH-; возьмите 3,0 мл промывочного супернатанта и добавьте 3,0 мл 1,3 моль-L-1 тиосульфата натрия и 1 ~ 2 капли фенолфталеина, если после встряхивания раствор не покраснел, значит, в MSCE нет свободных эпоксидных групп. Уравнение реакции обнаружения эпоксидной группы выглядит следующим образом:
6 Приготовление MSCE, иммобилизованного фермента нарингиназы
5,0 г MSCE, приготовленного по методу 5, добавляли к 50 мл раствора фермента нарингиназы с определенным pH, и реакцию колебали под водяной баней с постоянной температурой, как показано на рисунке 4. После реакции микросферы промывали буферным раствором несколько раз, пока на поверхности микросфер не оставалось свободной нарингиназы. Микросферы сливали с помощью воронки Бринелла для получения иммобилизованного фермента нарингиназы MSCE, который охлаждали при температуре 4 ℃ для последующего использования.
