Обзор методов иммобилизации ферментов на магнитных биополимерных микросферах

Магнитные биополимерные микросферы — это новый композитный материал, который сочетает в себе биологические материалы и неорганические магнитные материалы для формирования магнитно-чувствительных и биологически активных микросфер. Его свойства зависят от неорганических магнитных материалов, биологических материалов и способа их взаимодействия. В настоящее время наиболее широко используемым и изучаемым магнитным материалом являются магнитные наночастицы Fe3O4. Благодаря большой удельной поверхности, хорошей биосовместимости и высокому магнитному отклику, они могут быстро разделяться и целенаправленно перемещаться, что позволяет широко использовать их в пищевой и медицинской промышленности, охране окружающей среды и других областях. Биополимерные материалы в основном включают хитозан, альгинат натрия, желатин и др. Среди них хитозан является наиболее изученным биологическим материалом благодаря таким своим характеристикам, как хорошая биосовместимость, возобновляемые ресурсы и способность к биоразложению. Новый тип композитного материала, состоящий из хитозана и магнитного материала, обладает обоими превосходными свойствами, поэтому имеет широкие перспективы применения в различных областях.

1. Структура и свойства магнитных биополимерных микросфер

Структура магнитных биополимерных микросфер включает три типа: (1) структура ядро-оболочка; (2) гибридная структура; (3) многослойная сэндвич-структура, как показано на рисунке 1.

Рисунок 1 Структура магнитных биополимерных микросфер
Магнитные биополимерные микросферы обладают многими выдающимися свойствами, что делает их более подходящими для иммобилизации ферментов. Например, (1) эффект площади поверхности. Как правило, когда размер частиц магнитных биополимерных микросфер достигает микронного или даже нанометрового уровня, с увеличением удельной площади поверхности увеличивается плотность групп и селективная адсорбция микросфер, а также значительно повышается стабильность микросфер. (2) Магнитный эффект. Когда диаметр кристалла Fe3O4 составляет менее 30 нм, он обладает суперпарамагнетизмом, то есть магнетизм очень велик при условии внешнего магнитного поля. Когда внешнее магнитное поле удаляется, его магнетизм быстро исчезает, так что микросфера имеет магнитную ориентацию в условиях внешнего магнитного поля и может быстро отделяться от немагнитных материалов, и не намагничивается постоянно в магнитном поле, так что это не влияет на последующее использование. (3) Биосовместимость. В природе биологические материалы, такие как белки и полисахариды, обладают биосовместимостью, что делает их важными для применения в биомедицинской инженерии. (4) Функциональные характеристики основы. Биологические материалы, такие как хитозан и альгинат натрия, имеют большое количество активных групп (-OH, -COOH, -NH2), которые могут быть ковалентно соединены с биологически активными веществами или модифицированы определенными химическими группами.
2. Получение магнитных биополимерных микросфер
Получение магнитных биополимерных микросфер состоит из двух этапов. Первый этап — это получение магнитных наночастиц. В настоящее время для получения магнитных наночастиц Fe3O4 используются такие методы, как химическое соосаждение, термическое разложение солей железа, микроэмульсионный и гидротермальный методы. Среди них метод химического соосаждения прост и удобен в эксплуатации и является наиболее распространенным методом получения. Принцип метода химического соосаждения для синтеза Fe3O4 заключается в синтезе оксида железа путем нагревания и перемешивания смешанного солевого раствора с определенным соотношением Fe2+ и Fe3+ (1:2) в анаэробных условиях и быстрого добавления щелочи (аммиака или NaOH). Сюй и др. использовали метод химического соосаждения, добавив 4,34 ммоль FeCl2鑘4H2O и 8,67 ммоль FeCl3-6H2O, соответственно, и нагрев систему до 85 ℃ под азотом. После полного растворения, быстро добавьте 25 мл концентрированного аммиака и добавьте некоторое количество цитрата натрия, затем синтезируются магнитные наночастицы Fe3O4 с хорошей монодисперсностью и магнитной отзывчивостью.
После получения магнитных наночастиц их необходимо сшить с хитозаном для получения магнитных хитозановых микросфер. В настоящее время методы синтеза магнитных хитозановых микросфер в основном включают эмульсионный метод сшивания, метод распылительной сушки, фотохимический метод и метод in-situ. Среди них эмульсионный метод сшивания является более простым и наиболее широко используемым. Эмульсионный метод сшивания заключается в равномерном диспергировании Fe3O4 или магнитной жидкости в смешанной жидкости, содержащей хитозан, поверхностно-активное вещество и масляную фазу, с образованием микроэмульсионной системы «вода в масле», а затем добавлении глутаральдегида, в системе глутаральдегида и хитозана происходит реакция сшивания с образованием основания Шиффа, хитозан сшивается в сеть и затем покрывает Fe3O4 (как показано на рисунке 2). Цзян и др. использовали метод эмульсионного сшивания, используя Span 80, жидкий парафин и глутаральдегид в качестве поверхностно-активного вещества, диспергатора и сшивающего агента соответственно, для синтеза магнитных хитозановых микросфер правильной сферической формы с гладкой поверхностью.

Рисунок 2 Схема синтеза магнитных хитозановых микросфер методом эмульсионной сшивки

3. Иммобилизация фермента на магнитных композитных микросферах

После успешного приготовления магнитных хитозановых микросфер фермент может быть иммобилизован на них для использования. Поскольку хитозан богат активными аминогруппами и гидроксильными группами, он может вступать в реакцию с карбоксильными группами, аминогруппами, эпоксидными группами, бифункциональными группами и т.д. Магнитные микросферы из хитозана модифицируются по группам для удовлетворения потребностей в различной иммобилизации. Ниже представлены методы приготовления конкретных иммобилизованных ферментов по функциональным группам.

1) Иммобилизация ферментов на карбоксил-модифицированных магнитных композитных микросферах

Карбоксил-модифицированные магнитные композитные микросферы могут быть ковалентно связаны с аминогруппой фермента после активации карбодиимидным соединением в водном растворе, тем самым иммобилизуя молекулу фермента на магнитных композитных микросферах (рис. 3). Zhu Yihua и другие использовали улучшенный метод суспензионной полимеризации для сополимеризации обработанной стиролом магнитной жидкости и мономера метилакрилата через сшивающий мономер дивинилбензол, а затем с помощью гидролиза щелочью получили магнитный композит с хорошей монодисперсностью и богатыми карбоксильными группами. Микросферы используются для иммобилизации лактазы после активации карбодиимидным соединением. Наибольшая активность составляет около 360 U-g-1, а эффективность сшивания фермента — около 20 %.

Рисунок 3 Схема приготовления иммобилизованного фермента на карбоксил-модифицированных магнитных композитных микросферах
2) Иммобилизованный фермент на амино-модифицированных магнитных композитных микросферах

После того как амино-модифицированные магнитные композитные микросферы соединяются с соответствующим количеством глутаральдегида и активируются, они могут ковалентно связываться с аминогруппой на ферменте, тем самым иммобилизуя молекулы фермента на магнитных микросферах (рис. 4). Лю Ю и др. последовательно приготовили монодисперсные магнитные частицы SiO2 методом химического соосаждения и золь-гель методом, модифицировали их аминогруппами с помощью силанового соединительного агента и иммобилизовали лакказ с помощью глутаральдегида в качестве сшивающего агента. Результаты показали, что иммобилизованная лакказа выдерживалась при постоянной температуре 60 ℃ в течение 4 часов и сохраняла 60,9% ферментной активности, а после 10 циклов использования она сохраняла более 55% ферментной активности, а ее термическая стабильность и эксплуатационная устойчивость были значительно улучшены.

Рисунок 4 Схема приготовления иммобилизованного фермента на амино-модифицированных магнитных композитных микросферах

3) Иммобилизация фермента на эпокси-модифицированных магнитных композитных микросферах
Эпоксидная группа является чрезвычайно активной группой. Она может быть непосредственно ковалентно связана с биологическими группами без модификации. Поэтому после того, как эпоксидные модифицированные магнитные композитные микросферы ковалентно связываются с аминогруппой на ферменте для связывания фермента, молекулы иммобилизуются на магнитных микросферах (рис. 5). Йонг и др. приготовили магнитные микросферы с покрытием из олеиновой кислоты методом суспензионной полимеризации. Гидрофильные магнитные микросферы на основе эпоксидной смолы, полученные после активации метанолом, были использованы для иммобилизации липазы. Активность иммобилизованного фермента сохраняется на 64,2%, а его стабильность значительно повышается.

Рисунок 5 Схема получения иммобилизованного фермента на магнитных композитных микросферах на основе эпоксидной смолы

4) Иммобилизация ферментов на магнитных композитных микросферах, модифицированных бифункциональными группами
На бифункциональных магнитных микросферах сначала карбоксильные группы молекулы фермента и аминогруппы на микросферах быстро иммобилизуются на носителе за счет ионного взаимодействия, а иммобилизованный за счет ионного взаимодействия фермент ковалентно взаимодействует с эпоксидными группами на носителе через свои сульфгидрильные и аминогруппы. В результате фермент закрепляется (как показано на рисунке 6), обладая двойными характеристиками: быстрой фиксацией за счет ионного воздействия и прочной фиксацией за счет ковалентной связи. Ли Сютао и др. нанесли три случайные сополимерные щетки на поверхность сшитых дивинилбензолом микросфер из полиакриловой кислоты с диспергированными внутри наночастицами Fe3O4, а затем использовали для иммобилизации ацилазы пенициллина G. Результаты показывают, что активность и скорость восстановления ферментативной активности иммобилизованного фермента, в который одновременно введены эпоксидная и аминогруппа, наиболее высоки, кинетика иммобилизации лучше, чем у только эпоксидсодержащих магнитных микросфер, а оптимальное значение рН и температурная стабильность выше, чем у свободного фермента, и его ферментативная активность сохраняется на 70% после повторного использования в течение 10 раз.

Рисунок 6 Схема приготовления иммобилизованного фермента на магнитных композитных микросферах, модифицированных бифункциональными группами
В последние годы ученые использовали различные материалы для иммобилизации нарингиназы, такие как натуральные биополимерные материалы, такие как хитозан, альгинат натрия и протеин шелка, органические соединения, такие как эпоксидная смола и поливиниловый спирт, активированный уголь и графитовые оксидные углеродные материалы, такие как ene, и были получены определенные результаты исследований, но в реальном применении дебеттеринга существуют такие проблемы, как плохая кислотоустойчивость иммобилизованных ферментов, медленное отделение от сока или неполное отделение и т.д.. В связи с вышеуказанными проблемами в следующей статье будет подробно описана исследовательская работа. В этой работе исследователи использовали композитный материал, состоящий из хитозана, магнитных наночастиц Fe3O4 и диоксида кремния, модифицировали композитный материал эпоксидными группами, а затем иммобилизовали на нем нарингиназу. Данная работа послужит основой для дальнейшего изучения технологии иммобилизации нарингиназы.

 

Свяжитесь с нами сейчас!
Мы принимаем заказные услуги, обычно мы свяжемся с вами в течение 24 часов. Вы также можете написать мне по электронной почте info@longchangchemical.com в рабочее время (с 8:30 до 18:00 UTC+8 пн.-сб.) или воспользоваться чатом на сайте, чтобы получить быстрый ответ.
Эта статья была написана отделом исследований и разработок Longchang Chemical. При копировании и перепечатке, пожалуйста, указывайте источник.